- Код статьи
- 10.31857/S047514502306006X-1
- DOI
- 10.31857/S047514502306006X
- Тип публикации
- Статус публикации
- Опубликовано
- Авторы
- Том/ Выпуск
- Том 54 / Номер выпуска 6
- Страницы
- 415-428
- Аннотация
- Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.
- Ключевые слова
- индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) трансгенез система CRISPR/Cas9 нуклеаза AsCas12a (AsCpf1) изогенные клеточные линии
- Дата публикации
- 18.09.2025
- Год выхода
- 2025
- Всего подписок
- 0
- Всего просмотров
- 16
Библиография
- 1. Медведев С.П., Маланханова Т.Б., Валетдинова К.Р., Закиян С.М. Создание и исследование клеточных моделей наследственных нейродегенеративных заболеваний с помощью направленного редактирования геномов // Нейрохимия. 2021. Т. 38. № 4. С. 313–319.
- 2. Устьянцева Е.И., Медведев С.П., Ветчинова А.С. и др. Платформа для исследования механизмов нейродегенерации с помощью генетически кодируемых биосенсоров // Биохимия. 2019. Т. 84. № 3. С. 423–435.
- 3. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts // N. Engl. J. Med. 2004. V. 350. № 13. P. 1353–1356.
- 4. DeKelver R.C., Choi V.M., Moehle E.A. et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome // Genome Res. 2010. V. 20. № 8. P. 1133–1142.
- 5. Gao L., Cox D.B.T., Yan W.X. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 8. P. 789–792.
- 6. Grigor’eva E.V., Malankhanova T.B., Surumbayeva A. et al. Generation of GABAergic striatal neurons by a novel iPSC differentiation protocol enabling scalability and cryopreservation of progenitor cells // Cytotechnology. 2020. V. 72. P. 649–663.
- 7. Hellemans J., Mortier G., De Paepe A. et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data // Genome Biol. 2008. V. 8. P. R19.
- 8. Kim D., Kim J., Hur J.K. et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 863–868.
- 9. Kleinstiver B.P., Tsai S.Q., Prew M.S. et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 869–874.
- 10. Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V. et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population // Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101952.
- 11. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat. Protoc. 2013. V. 8. № 11. P. 2281–2308.
- 12. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 759–771.
