Russian Journal of Developmental BiologyRussian Journal of Developmental Biology0475-14503034-6266Russian Academy of Science10.31857/S0475145023010093High-Quality RNA Extraction and Evaluation of Reference Genes for qPCR Assay of Pinus sylvestris L. Trunk TissuesПолучение качественного препарата РНК и оценка референсных генов для постановки количественной ПЦР при работе с тканями ствола Pinus sylvestris L.MoshchenskayaYu. L.МощенскаяЮ. Л. moshchenskaya@krc.karelia.ruИнститут леса — обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”Forest Research Institute of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences010120235412740

Scots pine (Pinus sylvestris L.) is a species of tree with heartwood (HW), which is forming during aging of sapwood (SW). Due to clear-cut border between SW and HW P. sylvestris should be used as a model woody plant for studying patterns of HW formation. Currently, molecular genetic methods are used to study the processes of trunk tissues formation in woody plants often. A feature of trunk tissues of coniferous trees is a high content of secondary metabolites, a low content of nucleic acids, and potential partial degradation of RNA. In this work we discuss the choice of most successful method for extraction a high-quality RNA for real-time PCR (RT-PCR) in P. sylvestris trunk tissues along the radial vector “conductive phloem/cambial zone – differentiating xylem – exterior part of SW (1–2 annual rings) – interior part of SW (1–2 annual rings afore transition zone (TZ)) – TZ (2 annual rings afore HW)” for reproducible RT-PCR data. The expression stability of six potential reference genes (Actin1, α-Tubulin, β-Tubulin, Ef1a, GAPDH, UBQ) was assessed in all describe tissues. Differences in expression levels of target genes are shown by data normalization using reference genes with different stability of expression.

Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) относится к видам древесных растений, для которых характерно наличие ядровой древесины (HW), формирующейся в ходе старения заболони (SW). Благодаря четкой границе между SW и HW P. sylvestris может служить модельным древесным растением для изучения закономерностей формирования HW. В настоящее время для изучения процессов формирования тканей ствола древесных растений активно применяются молекулярно-генетические методы. Особенностью тканей ствола хвойных древесных растений является содержание большого количества вторичных метаболитов, низкое содержание нуклеиновых кислот и возможная частичная деградация РНК. В данной работе рассматривается выбор наиболее успешного метода выделения высококачественного препарата РНК для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в тканях ствола P. sylvestris по радиальному вектору “проводящая флоэма/камбиальная зона – дифференцирующаяся ксилема – внешняя часть SW (1–2 годичных кольца) – внутренняя часть SW (1–2 кольца перед транзитной зоной (TZ)) – TZ (2 кольца перед HW)” для получения воспроизводимых данных ПЦР-РВ. Во всех описанных тканях проведена оценка стабильности экспрессии шести потенциальных референсных генов (Actin1, α-Tubulin, β-Tubulin, Ef1a, GAPDH, UBQ). Показаны различия в уровнях экспрессии целевых генов при нормализации данных с использованием референсных генов с различной стабильностью экспрессии.

<i>Pinus sylvestris</i> выделение РНК нормализация ПЦР-РВ референсные гены экспрессия генов<i>Pinus sylvestris</i> выделение РНК нормализация ПЦР-РВ референсные гены экспрессия геновИсследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.Су М., Цзан В., Яо Н., Хуан М. Выделение высококачественной РНК из различных тканей Populus // Физиология растений. 2009. Т. 56. № 5. С. 791.Antonova G.F., Stasova V.V. Effects of environmental factors on wood formation in larch (Larix deciduas Ldb.) stems // Trees. 1997. V. 11. P. 462. https://doi.org/10.1007/PL00009687Bustin S.A., Beaulieu J.F., Huggett J., Jaggi R., Kibenge F.S., Olsvik P.A., Penning L.C., Toegel S. MIQE précis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments // BMC Mol. Biol. 2010. V. 11. P. 74. https://doi.org/10.1186/1471-2199-11-74Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Hugget J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments // Clinical Chemistry. 2009. V. 55. P. 611. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797Chan K.L., Ho C.L., Namasivayam P., Napis S. A simple and rapid method for RNA isolation from plant tissues with high phenolic compounds and polysaccharides // Protocol Exchange. 2007. https://doi.org/10.1038/nprot.2007Chang E., Shi S., Liu J., Cheng T., Xue L., Yang X., Yang W., Lan Q., Jiang Z. Selection of reference genes for quantitative gene expression studies in Platycladus orientalis (Cupressaceae) Using real-time PCR // PLoS One. 2012. V. 7(3): e33278.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033278Chang S., Puryear J., Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees // Plant Mol. Biol. Report. 1993. V. 11. P. 113.Chen H., Yang Z., Hu Y., Tan J., Jia J., Xu H., Chen X. Reference genes selection for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana L. // Trees. 2016. V. 30. P. 685. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205182Chen Y., Weining S., Daggard G. Preparation of total RNA from a very small wheat embryo suitable for differential display // Ann. Appl. Biol. 2003. V. 143. P. 261. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2003.tb00293.xChi X., Hu R., Yang Q., Zhang X., Pan L., Chen N., Chen M., Yang Z., Wang T., He Y., Yu S. Validation of reference genes for gene expression studies in peanut by quantitative real-time RT-PCR // Mol. Genet. Genomics. 2012. V. 287(2). P. 167. https://doi.org/10.1007/s00438-011-0665-5de Castro E., Sigrist C.J., Gattiker A., Bulliard V., Langendijk-Genevaux P.S., Gasteiger E., Bairoch A., Hulo N. ScanProsite: detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 362. https://doi.org/10.1093/nar/gkl124Fischer U., Kucukoglu M., Helariutta Y., Bhalerao R.P. The dynamics of cambial stem cell activity // Annu. Rev. Plant Biol. 2019. V. 70. P. 293. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050718-100402Ghawana S., Paul A., Kumar H., Kumar A., Singh H., Bhardwaj P.K., Rani A., Singh R.S., Raizada J., Singh K., Kumar S. An RNA isolation system for plant tissues rich in secondary metabolites // BMC Res. Notes. 2007. V. 4. P. 85. https://doi.org/10.1186/1756-0500-4-85Han X., Lu M., Chen Y., Zhan Z., Cui Q., Wang Y. Selection of reliable reference genes for gene expression studies using real-time PCR in tung tree during seed development // PLoS One. 2012. V. 7. P. e43084. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043084Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. P. 1870. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054Lal L., Sahoo R., Gupta R.K., Sharma P., Kumar S. RNA isolation from highphenolic tea leaves and apical buds // Plant Mol. Biol. Rep. 2001. V. 19. P. 181a. https://doi.org/10.1007/BF02772161Lim K.J., Paasela T., Harju A., Venäläinen M., Paulin L., Auvinen P., Kärkkäinen K., Teeri T.H. Developmental changes in scots pine transcriptome during heartwood formation // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 1403. https://doi.org/10.1104/pp.16.01082Marchler-Bauer A., Bryant S.H. CD-Search: protein domain annotations on the fly Nucleic // Acids Res. 2004. V. 32. P. 327. https://doi.org/10.1093/nar/gkh454Meyer-Gauen G., Herbrand H., Pahnke J., Cerff R., Martin W. Gene structure, expression inEscherichia coliand biochemicalproperties of the NAD1-dependent glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase from Pinus sylvestris chloroplasts // Gene. 1998. V. 209. P. 167. https://doi.org/10.1016/S0378-1119(98)00034-1Mo J., Xu J., Jin W., Yang L., Yin T., Shi J. Identification of reference genes for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana and its introgression hybrid // Forests 2019. V. 10. P. 787. https://doi.org/10.3390/f10090787Niu X., Zhang G., Xu J., Tao A., Fang P., Su J. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time PCR gene expression analysis in Jute (Corchorus capsularis) under stress treatments // Frontiers in Plant Science. 2015. V. 6. P. 848. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00848Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data // Neurosci. Lett. 2003. V. 339. P. 62. https://doi.org/10.1016/S0304-3940(02)01423-4Saitou N., Nei M. The Neighbor-Joining Method – a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454Svec D., Tichopad A., Novosadova V., Pfaffl M.W., Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments // Biomol. Detect. Quantif. 2015. V. 3. P. 9. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2015.01.005Taylor S., Wakem M., Dijkman G., Alsarraj M., Nguyen M. A practical approach to RT-qPCR–Publishing data that conform to the MIQE guidelines // Methods. 2010. V. 50. P. S1. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.005Zhu P., Ma Y., Zhu L., Chen Y., Li R., Ji K. Selection of suitable reference genes in Pinus massoniana Lamb. under different abiotic stresses for qPCR normalization // Forests. 2019. V. 10. P. 632. https://doi.org/10.3390/f10080632Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. E45. https://doi.org/10.1093/nar/29.9.e45