By this author

Transgenic Lines of Human Induced Pluripotent Stem Cells ICGi022-A-6 and ICGi022-A-7 with Doxycycline-Inducible Variants of Programmable Nuclease AsCas12a

Issue number 6 from 18.09.2025

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.

15 0